La Sindrome di Wolfram (WS) è una malattia genetica rara caratterizzata da diabete mellito, ipoacusia ed atrofia ottica progressiva. È causata da mutazioni a carico del gene WFS1, che mappa sul cromosoma 4p16 e codifica per la Wolframina, una proteina trans-membrana del reticolo endoplasmatico (RE) coinvolta nella regolazione dello stress cellulare. In questo studio, abbiamo effettuato la caratterizzazione molecolare e la correzione genica della nuova mutazione c.316-1G>A, situata nel sito accettore di splicing dell’esone 4. Abbiamo de-differenziato i linfociti circolanti del paziente in cellule staminali, le quali sono state differenziate in vitro nei due principali tessuti affetti dalla patologia: β-cellule e organoidi retinici. La caratterizzazione della mutazione è stata effettuata mediante RT-qPCR, deep sequencing e western blot. La correzione è avvenuta per ricombinazione omologa attraverso l’impiego di CRISPR/Cas9. Analizzando la regione tra gli esoni 3 e 5 nelle cellule staminali WS, abbiamo dimostrato che la mutazione determina la produzione di almeno quattro trascritti alternativi conseguenti alla distruzione del sito canonico di splicing. In particolare, due di questi trascritti mantengono il frame di lettura e pertanto codificano per forme di proteina prive di una porzione all’interno del dominio N-terminale. Le isoforme internamente tronche inoltre hanno una minore stabilità, che si traduce in ridotti livelli di proteina. Questi trascritti alternativi sono conservati sia nelle β-cellule che negli organoidi retinici derivati da staminali. Al contrario, le cellule mononucleate del sangue periferico mostrano un numero ed una qualità di trascritti molto diversi, che sottendono ad una regolazione tessuto-specifica dei meccanismi di splicing. La correzione genetica della mutazione c.316-1G>A ripristina il sito canonico di splicing e abolisce le forme aberranti di trascritto, ristabilendo livelli normali di produzione dell’mRNA e della proteina completa, sia nelle staminali che in quelle differenziate. La correzione garantisce il rescue del fenotipo patologico, prevenendo l’induzione di apoptosi da stress osservata nelle β-cellule affette.