L’uso di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) nel diabete di tipo 1 (T1D), malgrado le sue potenzialità, presenta ancora notevoli limitazioni: da un lato, il trapianto autologo di beta cellule derivate da iPSC non risolve i problemi dell’autoimmunità; dall’altro, quello allogenico è inficiato dal rischio elevato di rigetto, mediato dai linfociti T CD8+. Le attuali strategie di immuno-evasione consistono nell’inattivazione del gene della beta-2-microglobulina (B2M), responsabile della presentazione in membrana delle MHC di classe I. Tuttavia, il trapianto di cellule non esprimenti le HLA di classe I è causa, a sua volta, di una risposta immunitaria mediata da cellule NK. Il nostro studio propone di generare una linea di iPSC, knock-out per B2M, quindi deficitaria delle MHC di classe I, ma esprimente le proteine tollerogeniche HLA-E e HLA-G, allo scopo di eludere sia la risposta mediata da CD8+ che da NK. La linea iPSC ingegnerizzata è stata dunque differenziata in beta cellule destinate alla terapia cellulare del T1D.
Abbiamo usato il sistema CRISPR-Cas9 per mediare l’ingresso nel primo esone della B2M dei geni HLA-E, HLA-G1 e/o HLA-G6. Le cellule Jurkat sono state inizialmente utilizzate per testare l’efficienza del gene editing e per gli studi di citotossicità. La strategia di editing è stata quindi implementata su iPSC umane, permettendo di ottenere linee sia B2M-/- che B2M-/- HLA-E/G+/+. Le iPSC editate sono infine state differenziate in beta cellule, seguendo un protocollo in vitro che mima gli stadi dello sviluppo pancreatico. Il knocking-down della B2M, contestualmente all’espressione di HLA-E/G, riduce significativamente la citotossicità mediata da CD8+ ed NK. Il differenziamento della linea B2M-/- in beta cellule non mostra alterazioni quando comparato con quello delle cellule wild type, come confermato dalla valutazione di diversi markers di differenziamento pancreatico, tra cui PDX1, NKX6.1 e Insulina. Attualmente è in corso di valutazione il differenziamento della linea B2M-/- HLA-E/G+/+, nonché il suo profilo di immunogenicità.
Questo progetto rappresenta un passo in avanti nella terapia cellulare del T1D e, in generale, nel campo della medicina rigenerativa, tramite la produzione di cellule staminali non immunogeniche.