Abstract
Il meccanismo di secrezione insulinica della β-cellula, innescato dall’innalzamento della glicemia, richiede lo sbilanciamento del rapporto ATP/ADP, principalmente dovuto all’aumento della produzione mitocondriale di ATP. Durante le tappe iniziali della respirazione cellulare (glicolisi, ciclo di Krebs), un importante cofattore enzimatico, il NADH, viene ridotto e impiegato nel mitocondrio come coenzima nella catena di trasporto elettronico della fosforilazione ossidativa. I livelli cellulari di NADH, nelle sue forme libera e legata agli enzimi, forniscono un’indicazione importante nel comprendere lo stato metabolico della cellula: più orientato verso le reazioni glicolitiche e del ciclo di Krebs (presenza di NADH libero) oppure verso la fosforilazione ossidativa dove viene prodotto ATP (NADH legato). La microscopia a fluorescenza a 2 fotoni, coadiuvata dalla misurazione del tempo di vita delle specie fluorescenti, permette proprio di distinguere attraverso l’eccitazione del NADH, intrinsecamente fluorescente, la localizzazione intracellulare delle sue due forme, quella libera e quella legata. Si ottiene così una mappa colorimetrica della distribuzione intracellulare delle due specie chimiche che permette di studiarne le variazioni indotte dagli stimoli secretori. A tale scopo, cellule INS-1E sono state analizzate nella loro condizione di mantenimento a 11mM di glucosio e in condizioni di crescita iperglicemiche (30mM) per 48 ore. L’attività metabolica è stata misurata in entrambi i casi sottoponendo le cellule a stimolo indotto da glucosio 16mM, preceduto da una transitoria incubazione a 3.3mM di glucosio. Le cellule cresciute in condizioni normali hanno mostrato un significativo aumento della forma legata del NADH a seguito di stimolazione (Fig. A), indice di un’incrementata attività di fosforilazione ossidativa (produzione di ATP). Al contrario, le cellule cresciute in condizioni iperglicemiche non hanno evidenziato la medesima variazione dell’attività metabolica (Fig. B), indicazione di una capacità di risposta allo stimolo attenuata (come confermato dai relativi saggi di secrezione insulinica). Questa dimostrazione apre a nuove applicazioni per lo studio dell’attività metabolica in Isole di Langerhans integre, lasciando imperturbato il campione e sfruttandone la naturale autofluorescenza.
Tipo: PD
Codice: 9
